La PCR en tiempo real o qPCR (por sus siglas en inglés) es una técnica molecular de gran utilidad en la investigación científica y en la industria, ya que permite amplificar y cuantificar el ADN de forma rápida y precisa.
La qPCR se diferencia de la PCR convencional en que utiliza una técnica de detección en tiempo real que permite medir la cantidad de ADN amplificado durante el ensayo. En la qPCR se utiliza una sonda fluorescente que se hibrida con la secuencia amplificada, y emite una señal fluorescente cuando se excita con luz a una longitud de onda específica. A medida que se amplifica el ADN, aumenta la cantidad de sonda fluorescente unida al ADN amplificado, lo que se traduce en un aumento en la señal fluorescente detectada. La intensidad de la señal fluorescente se mide en cada ciclo de la PCR y se utiliza para cuantificar la cantidad de ADN presente en la muestra. Actualmente, existen dos tipos de sondas para cuantificar la amplificación en un ensayo de qPCR: tinte fluorescente y sonda fluorescente.
Se trata de sonda que es un tinte fluorescente que se une al ADN de forma inespecífica. Durante la reacción de qPCR, el tinte se intercalará entre las hebras de ADN amplificadas, lo que resulta en un aumento de la señal fluorescente proporcional a la cantidad de ADN presente en la muestra. La detección se basa en la emisión de fluorescencia cuando se excita con una luz de una longitud de onda específica. Una de las ventajas de esta sonda-tinte es que puede utilizarse con una amplia variedad de cebadores y no requiere la síntesis de sondas específicas. Sin embargo, su capacidad de unión inespecífica puede generar resultados falsos positivos si hay productos de amplificación no deseados presentes.
Este tipo de sonda, por otro lado, es un enfoque que utiliza sondas específicas diseñadas para la secuencia objetivo. Las sondas específicas se componen de un fluoróforo en un extremo y un quencher en el otro. Durante la amplificación, la Taq polimerasa se encuentra con la sonda y comienza a sintetizar nuevas cadenas de ADN. La actividad exonucleasa de la Taq polimerasa degrada la sonda liberando el fluoróforo del quencher, lo que permite la emisión de una señal fluorescente detectable. Esta liberación del fluoróforo solo ocurre cuando la sonda se hibrida específicamente con la secuencia objetivo, lo que confiere una alta especificidad al ensayo de qPCR con sonda fluorescente.
La qPCR se utiliza ampliamente en diferentes campos de investigación e industria. Por ejemplo, se utiliza en la detección de enfermedades infecciosas, donde se pueden diseñar cebadores específicos para identificar la presencia de un patógeno en particular. También se utiliza en la identificación de organismos genéticamente modificados, donde se pueden diseñar cebadores específicos para detectar la presencia de secuencias de ADN transgénicas. Además, la qPCR es una técnica muy útil en el diagnóstico de enfermedades hereditarias, donde se pueden diseñar cebadores específicos para detectar mutaciones en los genes asociados con la enfermedad.
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